鑒于此，本研究首先采用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)，分析二級(jí)出水中微生物群落結(jié)構(gòu)特性，揭示二級(jí)出水中常見的幾種病原菌; 然后采用培養(yǎng)法、 qPCR及Q-RT-PCR方法考察了紫外消毒對(duì)該污水廠二級(jí)除水中指示菌和病原菌的去除特性，以期為污水回用中病原菌的去除工藝提供一些參考，保障污水回用的衛(wèi)生學(xué)安全.
1 材料與方法
1.1 樣品采集及實(shí)驗(yàn)（experiment)設(shè)置
本研究樣品采自南方某生活污水處理廠二級(jí)出水，該廠采用傳統(tǒng)活性污泥法，二級(jí)處理采用空氣曝氣活性污泥法，該廠進(jìn)水與出水的水質(zhì)參數(shù)情況如表 1所示. 二級(jí)出水的取樣體積為5 L. 樣品取好后放置于采樣箱中，于2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，1 L水樣用于群落結(jié)構(gòu)分析. 共采樣5次.
表 1 本實(shí)驗(yàn)（experiment)用再生水的水質(zhì)參數(shù)
紫外消毒對(duì)病原菌的影響在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行. 紫外輻射(Radiation)采用超凈臺(tái)中的紫外燈管進(jìn)行. 經(jīng)紫外輻射計(jì)測(cè)定，本研究采用的紫外燈管對(duì)實(shí)驗(yàn)中水樣放置區(qū)域的紫外照射強(qiáng)度均勻. 實(shí)驗(yàn)中采用校準(zhǔn)的紫外輻射計(jì)對(duì)玻璃杯處的紫外強(qiáng)度為 0.1mW ?cm-
2. 將1.5 L水樣倒入2L燒杯中，放入磁性轉(zhuǎn)子（rotor），將燒杯放在磁力攪拌器上，打開超凈臺(tái)的紫外燈，使得水樣接受紫外照射. 實(shí)驗(yàn)所需的紫外線劑量=紫外線強(qiáng)度×照射時(shí)間.
《城鎮(zhèn)給排水紫外線消毒設(shè)備》標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：城鎮(zhèn)生活飲用水的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)為40 mJ ?cm-2，中水回用的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)為80 mJ ?cm-2，城鎮(zhèn)污水的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)為15 mJ ?cm-2，城鎮(zhèn)污水的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)為20 mJ ?cm-
2. 紫外線消毒設(shè)備應(yīng)用于城市雜用水、 景觀環(huán)境用水時(shí)，應(yīng)分別達(dá)到GB-T 18920和GB-T 50335中的衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)要求. 再生水作為景觀環(huán)境用水時(shí)糞大腸菌群要求小于200 CFU ?L-
1. 本研究中，設(shè)定紫外線劑量20、 40、 60、 80 mJ ?cm-2時(shí)，分別用培養(yǎng)法檢測(cè)糞大腸菌群的濃度水平，考察不同紫外劑量對(duì)本樣品中微生物的去除水平，以選擇合適的紫外劑量.
經(jīng)選擇，考慮經(jīng)濟(jì)(jīng jì)成本，最終設(shè)定紫外線劑量為60mJ ?cm-2，即照射時(shí)間為10 min. 照射后在黑暗條件下放置12 h. 本實(shí)驗(yàn)在室溫環(huán)境下進(jìn)行，反應(yīng)終止后采用培養(yǎng)法和qPCR及Q-RT-PCR檢測(cè)消毒前后大腸桿菌、 沙門氏菌及分枝桿菌的濃度.
1.2 二級(jí)出水中微生物多樣性分析
1.2.1 DNA的提取
將1L水樣經(jīng)醋酸纖維素濾膜過濾，將過濾下的物質(zhì)于濾膜一同轉(zhuǎn)入15 mL無菌離心管中，加入10 mL滅菌后的PBS在漩渦振蕩器上洗脫過濾截留的顆粒物. 將濾膜取出，離心管置于4℃離心10 min，轉(zhuǎn)速設(shè)為10 000 r ?min-
1. 棄去上清液，將底部物質(zhì)轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，于4℃離心5 min，轉(zhuǎn)速為12 000 r ?min-
1. 棄去上清液，管內(nèi)留500 μL液體進(jìn)行DNA的提取. DNA提取采用FastDNA@ Spin Kit for Soil試劑盒，具體操作過程按說明書進(jìn)行. 最后得到DNA體積為50 μL.對(duì)得到的DNA進(jìn)行純化，采用Universal DNA 純化回收試劑盒. 提取后的DNA用于454焦磷酸測(cè)序.
1.2.2 PCR擴(kuò)增
PCR擴(kuò)增區(qū)域?yàn)榧?xì)菌16S rRNA的V1-V3區(qū)，擴(kuò)增長(zhǎng)度為500 bp. 上游引物為：27F：5′- 融合 A-標(biāo)簽-CA接頭-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，下游引物為：533R：5′- 融合 B-TC 接頭-TTACCGCGG CTGCTGGCAC-3′. 為了區(qū)分同一體系中的不同樣品，在引物前端加入一個(gè)10 bp的標(biāo)簽. PCR反應(yīng)體系為50 μL：5×FastPfu Buffer 10 μL; 2.5 μmol ?L-1 dNTPs 5 μL; 5 μmol ?L-1上下游引物2 μL; FastPfu Polymerase 1 μL; DNA模板100-200 ng; 其余用雙蒸水補(bǔ)足50 μL. PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋合?5℃ 2 min; 然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán),最后72℃ 10 min. 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳在500 bp位置處檢測(cè)到條帶，將PCR產(chǎn)物用TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物. 采用分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度及質(zhì)量.
1.2.3 454文庫構(gòu)建和測(cè)序
應(yīng)用高通量測(cè)序平臺(tái)GS 454 FLX Titanium對(duì)標(biāo)記的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序. 測(cè)序完成后對(duì)所得序列進(jìn)行處理，處理原則如下：
①檢測(cè)標(biāo)簽的完整性，棄去標(biāo)簽不完整的序列;
②棄去片段長(zhǎng)度低于200 bp的序列;
③篩除尾部質(zhì)量數(shù)低于20的末端序列;
④保證每個(gè)樣品系列中80%以上堿基的序列質(zhì)量數(shù)大于20[10].
1.2.4 測(cè)序結(jié)果分析及分類學(xué)分析
對(duì)1.2.3節(jié)得到的有效序列比對(duì)至SILVA數(shù)據(jù)庫的16S rRNA序列上，去除目標(biāo)區(qū)域以外的序列. 利用mothur軟件，根據(jù)每組中的重復(fù)（repeat)序列，去除嵌合體序列，通過對(duì)RDP數(shù)據(jù)庫中的PDS序列進(jìn)行比對(duì)，排除（Remove)葉綠體、 線粒體、 古細(xì)菌、 真核序列的干擾. 根據(jù)序列的相似性，將之歸為多個(gè)OUT. 選擇相似水平為0.03的進(jìn)行后續(xù)分析(Analyse),構(gòu)建稀疏曲線. 利用mothur軟件計(jì)算樣本的Chao豐度指數(shù)，Shannon多樣性指數(shù)，Simpson多樣性指數(shù)，覆蓋度指數(shù)及Pielou均勻度指數(shù).
1.3 細(xì)菌的檢測(cè) 本研究中選擇常用的指示菌大腸桿菌作為目標(biāo)指示菌. 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，最終選擇沙門氏菌和分枝桿菌作為待檢測(cè)的病原菌. 分別采用培養(yǎng)法、 qPCR及Q-RT-PCR方法檢測(cè)水樣中細(xì)菌的濃度水平.
1.3.1 培養(yǎng)法
大腸桿菌、 沙門氏菌及分枝桿菌的培養(yǎng)法檢測(cè)參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行.
1.3.2 DNA提取
消毒前病原菌的分析采用1.2.1節(jié)提取得到的DNA. 消毒后濃縮1L待測(cè)樣品，提取過程按照1.2.1節(jié)進(jìn)行.
1.3.3 qPCR
qPCR引物及探針的選擇
本研究中大腸桿菌和分枝桿菌的qPCR檢測(cè)采用SYBR® Green qPCR. 采用Taqman® qPCR定量檢測(cè)沙門氏菌. 所采用的目的基因和相應(yīng)引物序列見表 2.
表 2 定量PCR采用的目的基因和相應(yīng)引物序列
qPCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備
標(biāo)準(zhǔn)品采用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，制作方法參見文獻(xiàn)[15]，制備含有uid
A、 invA和hsp65基因的質(zhì)粒DNA.
大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建過程中采用大腸桿菌和與uidA基因相應(yīng)的引物，沙門氏菌和與invA基因相應(yīng)的引物，分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建采用分枝桿菌和hsp65基因相應(yīng)的引物，目標(biāo)基因經(jīng)PCR擴(kuò)增之后將特異性產(chǎn)物連接入pCR 2.1-TOPO載體 中，經(jīng)過酶切鑒定測(cè)序分析和質(zhì)粒提取等步驟獲得大腸桿菌DNA標(biāo)準(zhǔn)品. 采用核酸蛋白儀測(cè)量DNA的濃度. 將得到的質(zhì)粒DNA按10倍梯度稀釋，制得qPCR標(biāo)準(zhǔn)品.
qPCR測(cè)定
大腸桿菌及分枝桿菌qPCR反應(yīng)體系為：SYBR® Premix Ex TaqTM 10 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA5 μL，雙蒸水4 μL. 沙門細(xì)菌qPCR反應(yīng)體系為：Premix Ex TaqTM 12.5 μL，上下游引物各2.5 μL，Taqman® 熒光探針1 μL，DNA5 μL，雙蒸水1.5 μL補(bǔ)足體積至25 μL.
大腸桿菌反應(yīng)程序如下：1個(gè)循環(huán)：95℃，1 min; 40個(gè)循環(huán)：95℃，20 s; 60℃，20 s; 72℃，15 s; 熔解曲線的過程為：95℃，1 min，從60℃開始每30 s溫度升高0.5℃，總共進(jìn)行71個(gè)循環(huán)，結(jié)束溫度為95℃，反應(yīng)結(jié)束之后4℃保存.
沙門氏菌反應(yīng)程序如下：1個(gè)循環(huán)：95℃，10 min; 40個(gè)循環(huán)：95℃，20 s; 60℃，30 s; 72℃，25 s; 不設(shè)置熔解曲線，反應(yīng)結(jié)束之后4℃保存.
分枝桿菌反應(yīng)程序如下：1個(gè)循環(huán)：94℃，1 min; 40個(gè)循環(huán)：94℃，60 s; 60℃，60 s; 72℃ 60 s; 熔解曲線過程為同大腸桿菌.
每次定量PCR反應(yīng)都設(shè)空白對(duì)照，每次測(cè)定設(shè)2個(gè)平行樣.
1.3.4 Q-RT-PCR
Q-RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備參考文獻(xiàn)[7].
樣品的濃縮參照1.2.
1. RNA的提取采用Fast RNA® Pro Soil-Direct Kit.
2 結(jié)果與討論 2.1 二級(jí)出水中微生物群落結(jié)構(gòu)組成 2.1.1 微生物多樣性分析
通過對(duì)5個(gè)批次樣品16S rRNA基因文庫進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，經(jīng)修剪去雜后，共獲得1 128、 1 299、 1 292、 1 019和1 462條優(yōu)化序列，序列平均長(zhǎng)度為545 bp. 將優(yōu)化序列截齊后與SILVA比對(duì)后進(jìn)行聚類，在97%相似性下分別獲得252、 264、 375、 315和554 OTUs，稀疏曲線如圖 1所示. 從中可知，當(dāng)測(cè)序數(shù)量超過1 000時(shí)，仍有新的OUT可被測(cè)出. 稀疏曲線隨測(cè)序序列增加趨向平坦，表明本研究樣本取樣量合理. 表 3列出了α多樣性分析各樣品的多樣性指數(shù).
圖 1 二級(jí)出水樣品的稀疏曲線
表 3 二級(jí)出水中微生物物種豐富（plump)度和多樣性評(píng)價(jià)
對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行門的組成進(jìn)行分析，分析結(jié)果如圖 2所示. 相似性為97%時(shí)，樣品中共檢測(cè)到21個(gè)門，包括酸桿菌門、 放線菌門、 、 擬桿菌門、 綠彎菌門、 藍(lán)細(xì)菌門、 Deinococcus-Thermu
S、 厚壁菌門、 梭桿菌門、 Gemmatimonadet
E、 硝化螺旋菌門、 浮霉菌門、 變形菌門、 螺旋菌門、 互養(yǎng)菌門和疣微菌門. 樣品中有794條序列不能被分入已知菌門，這些細(xì)菌可能是未知菌種.
圖 2 樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)門比例組成
由圖 2可知，樣品中包括藍(lán)細(xì)菌門、 擬桿菌門、 厚壁菌門、 變形菌門這4個(gè)主要門及未定菌和其它未分類菌. Ye等[16]在研究香港一座采用活性污泥法的污水廠微生物群落結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)，污水廠二級(jí)出水中變形菌門是最主要的細(xì)菌群. Lee等[17]在研究首爾不同污水廠進(jìn)水及活性污泥的微生物群落結(jié)構(gòu)中同樣也發(fā)現(xiàn)，變形菌門、 擬桿菌門及厚壁菌門是依次最主要的3個(gè)細(xì)菌群. Shu等[18]在研究陜西6座污水處理廠厭氧消化污泥的微生物群落結(jié)構(gòu)中，也得到了同樣的結(jié)論，變形菌門、 擬桿菌門、綠彎菌門及厚壁菌門是依次主要的4個(gè)細(xì)菌群. 本研究得到的結(jié)論與這些研究結(jié)果相一致.
對(duì)兩個(gè)主要門變形菌門和擬桿菌門進(jìn)行進(jìn)一步分析，結(jié)果如圖 3所示.
由圖 3可知，變形菌門主要由α-、 β-和γ-Proteobacteria這3個(gè)主要亞綱組成，分別為23.9%、 43.5%和12.9%. 值得注意的是β-Proteobacteria亞綱包含許多種類的致病菌，在本研究中也檢測(cè)到. 由圖 3可知，擬桿菌門主要由Flavobacteri
A、 Sphingobacteria和Bacteroidia這3個(gè)主要綱組成，分別為79.5%、 11.6%和2.5%. 上述研究結(jié)果與Hu等[10]的研究結(jié)果相一致.
圖 3 樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)綱水平比例組成
2.1.2 主要病原菌解析（analysis 剖析；深入分析)
病原菌的去除是保障污水回用衛(wèi)生學(xué)安全的重要組成. 綜合國(guó)內(nèi)外研究病原菌分類[19, 20]，本研究共發(fā)現(xiàn)11種病原菌，其中梭菌屬、 弓形桿菌屬和分支桿菌的包含比重較高，此外常見的病原菌埃希氏菌和志賀氏菌和軍團(tuán)菌也均檢測(cè)到. 弓形桿菌屬是革蘭氏陰性螺旋形微生物，屬于彎曲桿菌科[21]，會(huì)引起腹瀉、 腹痛等癥狀. 對(duì)一些消毒劑的耐受性較強(qiáng)，在深度處理過程中較難去除[22]. 分枝桿菌屬大部分種類是機(jī)會(huì)致病菌，可能會(huì)引起系列人類感染疾病[23]. 分枝桿菌是革蘭氏陽性菌，其特殊的生理性能使得其對(duì)各種消毒劑具有較好的抗性[24]. 此外，該細(xì)菌可以寄生于阿米巴蟲身上，進(jìn)一步增強(qiáng)了他們的耐消毒性[25]. 在污水回用中需采用別的處理方法進(jìn)行去除. 梭菌屬是革蘭氏陽性菌，在污水處理廠中普遍存在[19]，會(huì)引起破傷風(fēng)等各類疾病. 梭菌屬為專性厭氧微生物，能形成孢子，使其對(duì)氧化性消毒劑具有極強(qiáng)的耐受性[26]. 但是，梭菌屬對(duì)紫外消毒則較為敏感[27, 28]，這主要由于紫外消毒并不是通過氧化作用破外細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而是直接導(dǎo)致核酸突變，阻礙其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，封鎖及阻礙蛋白質(zhì)的合成同時(shí)產(chǎn)生的自由基可引起光電離，最終導(dǎo)致微生物死亡[29, 30]. 不同病原菌的生理特性不同，在深度處理過程中應(yīng)結(jié)合不同病原菌的生理特性設(shè)置處理來去除污水中的病原菌.
表 4 樣品中各病原菌比例
2.2 紫外消毒對(duì)指示菌與病源菌的殺滅特性細(xì)菌的影響
不同紫外劑量下，大腸桿菌的篩除效果如圖 4所示. 從中可知，當(dāng)紫外劑量為60 mJ ?cm-2時(shí)，對(duì)大腸桿菌的去除率達(dá)到3.2個(gè)數(shù)量級(jí)，出水濃度為113 CFU ?L-1可以滿足再生水用作景觀用水時(shí)的衛(wèi)生學(xué)要求. 因此，本研究考察紫外劑量為60 mJ ?cm-2對(duì)不同病原菌的去除效果.
圖 4 大腸桿菌的紫外消毒曲線
本研究（research)中qPCR的線性檢測(cè)區(qū)間如下：大腸桿菌為3×102～3×108 copies ?reaction-1; 沙門氏菌為6×102～6×108 copiese ?reaction-1; 分枝桿菌為8×101～8×108 copies ?reaction-
1. 大腸桿菌、 沙門氏菌與分枝桿菌的線性相關(guān)系數(shù)均>0.99，PCR擴(kuò)增效率在95%-110%之間. 大腸桿菌及分枝桿菌的熔解曲線呈現(xiàn)單一的熔點(diǎn)峰，峰值為87℃±0.5℃. 表明本研究所采用的qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)性較好，擴(kuò)增效率較高，對(duì)細(xì)菌的特異性較強(qiáng).
本研究中Q-RT-PCR的線性監(jiān)測(cè)區(qū)間如下：大腸桿菌、 沙門氏菌和分枝桿菌均為1×102-1×109copies ?reaction-
1. 大腸桿菌與分枝桿菌的線性相關(guān)系數(shù)均>0.99，PCR擴(kuò)增效率在95%-115%之間.
采用培養(yǎng)法、 qPCR及Q-RT-PCR方法檢測(cè)水源地水樣消毒前后大腸桿菌、 沙門氏菌與分枝桿菌的濃度水平，檢測(cè)結(jié)果如圖 5所示. 從中可知，60 mJ ?cm-2劑量紫外消毒對(duì)可培養(yǎng)大腸桿菌及沙門氏菌的篩除率約為99.9%. 靳慧霞等人在研究紫外消毒對(duì)大腸桿菌滅活效率的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)消毒劑量為60 mJ ?cm-2時(shí)，大腸桿菌的去除率為99.99%[31]. 本研究相同劑量下，可培養(yǎng)大腸桿菌的去除率較低，這可能是由于紫外消毒會(huì)受到水體濁度、 有機(jī)物等的影響[32]. 但是，相同劑量的紫外消毒對(duì)可培養(yǎng)分枝桿菌的去除率不足90%，這與分枝桿菌特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān). 分枝桿菌的細(xì)胞膜富含脂類，細(xì)胞膜厚，具有疏水性，使得分枝桿菌對(duì)外界環(huán)境的抵抗性較強(qiáng)[33, 34].
qPCR檢測(cè)消毒前后大腸桿菌、 沙門氏菌及分枝桿菌的濃度水平的變化并不顯著. 這表明紫外消毒對(duì)細(xì)菌基因片段的破壞速率遠(yuǎn)小于其對(duì)細(xì)菌可培養(yǎng)性的破壞速率. qPCR檢測(cè)的是目標(biāo)(cause)菌的目的基因片段而不是整個(gè)基因組，由于檢測(cè)的目的基因的片段較短，無法很好地指示整個(gè)基因組的受損情況. Q-RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)60 mJ ?cm-2劑量紫外消毒后，活性大腸桿菌、 沙門氏菌及分枝桿菌的濃度水平下降不顯著. 結(jié)合培養(yǎng)法的結(jié)果，細(xì)菌雖然無法在培養(yǎng)基上形成菌落，但是仍具有逆轉(zhuǎn)錄活性，這表明細(xì)菌仍具有一定活性. 這可能是由于經(jīng)過紫外照射后細(xì)菌可能進(jìn)入VBNC狀態(tài)，無法在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但仍具有細(xì)胞活性，可在一定條件下恢復(fù)其可培養(yǎng)性[35, 34]. 值得注意的是，分枝桿菌qPCR及Q-RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果較培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果高2個(gè)數(shù)量級(jí). 有學(xué)者指出，由于分枝桿菌種類較多，生長(zhǎng)條件不同，一種培養(yǎng)基可能無法檢測(cè)到所有的分枝桿菌，采用qPCR的檢測(cè)結(jié)果會(huì)比培養(yǎng)法高1個(gè)多數(shù)量級(jí)[36]. 此外，Q-RT-PCR的檢測(cè)較qPCR略低，這是由于qPCR檢測(cè)到的是所有具有目的基因的DNA片段，而Q-RT-PCR檢測(cè)到的僅是具有逆轉(zhuǎn)錄活性的RNA片段，因此Q-RT-PCR比qPCR較好地指示污水中的活性病原菌的濃度水平.
圖 5 培養(yǎng)法、 qPCR及Q-RT-PCR對(duì)不同指示菌的檢測(cè)(檢查并測(cè)試)結(jié)果
上述研究結(jié)果表明，紫外消毒能夠抑制大腸桿菌及沙門氏菌的可培養(yǎng)性，但這些細(xì)菌尚能保持逆轉(zhuǎn)錄
