近年來，分子生物學作為有效手段用來研究污水處理過程中微生物群落結(jié)構(gòu)特性，如變形梯度凝膠電泳、克隆文庫和高通量測序等. MiSeq高通量測序以Illumina的測序技術(shù)為基礎(chǔ)，通過可逆終止試劑方法對數(shù)百萬個基因片段同時進行大規(guī)模平行測序，具有分析結(jié)果精確、高速等特點，被廣泛(extensive)應(yīng)用于污水處理過程中微生物結(jié)構(gòu)和多樣性研究.
本文以顆粒硫磺和黃鐵礦的硫自養(yǎng)反硝化反應(yīng)器為研究對象，探究反應(yīng)器在經(jīng)過30 d饑餓忍耐后的恢復(fù)情況，并利用MiSeq高通量測序?qū)︷囸I忍耐前后反應(yīng)器中細菌群落的變化情況進行分析，以期為污水處理廠脫氮保障工藝的季節(jié)性、間歇性運行提供技術(shù)參考.
1 材料與方法1.1 試驗裝置
硫自養(yǎng)反硝化工藝采用降流式生物濾池，試驗裝置示意圖如圖 1所示.反應(yīng)器為密封的有機玻璃材質(zhì)柱，內(nèi)徑140 mm，高度1 170 mm，填充高度500 mm，有效容積5.94 L.進水口距柱底600 mm，沿反應(yīng)器不同高度處分別設(shè)置取填料口，取填料口距填料頂部的距離分別是100 mm和300 mm.
圖 1 試驗裝置示意
試驗共設(shè)2個反應(yīng)器，1號反應(yīng)器加入硫磺和白云石的混合物，2號反應(yīng)器加入黃鐵礦和白云石的混合物. 2個反應(yīng)器中的填料均按
1:1的體積比混合裝填，硫磺、黃鐵礦和白云石的粒徑均為5~10 mm.其中，硫磺/白云石的填充區(qū)域孔隙率為45.9%，黃鐵礦/白云石為44.1%.
1.2 進水水質(zhì)和接種污泥
本試驗用水為人工模擬污水廠尾水，水質(zhì)指標為: NO3--N濃度為30 mg?L-1，NH4+-N濃度為2 mg?L-1，TP濃度為1 mg?L-1，COD濃度為18~23 mg?L-1，pH為6.8~7.2.接種污泥取自高碑店污水處理廠二沉池回流污泥.
1.3 反應(yīng)器運行方式
反應(yīng)器在低溫下運行85 d ，主要分為穩(wěn)定（解釋:穩(wěn)固安定；沒有變動)期、饑餓期和恢復(fù)期:穩(wěn)定期，正常進水，反應(yīng)器穩(wěn)定運行，平均溫度為12℃;饑餓期，停止進水，反應(yīng)器處于饑餓狀態(tài)，平均溫度12.8℃;恢復(fù)期，恢復(fù)進水，反應(yīng)器進入恢復(fù)期，平均溫度為14℃.饑餓期結(jié)束后及恢復(fù)期采集反應(yīng)器中的污泥樣品 進行MiSeq高通量測序分析，分析反應(yīng)器饑餓期及穩(wěn)定期細菌群落的變化情況.
1.4 測試指標和方法1.4.1 水質(zhì)指標的測定
反應(yīng)器運行期間，定期采樣進行水質(zhì)指標的測定，檢測項目包括氨氮水(Nitric acid)鹽氮、亞硝氮、總氮、總磷(P) 等.其中NO3--N采用紫外分光光度法測定;NO2--N采用N--乙二胺分光光度法測定;TN采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定;TP采用鉬酸鹽分光光度測定.試驗所用分光光度計為HACH DR5000紫外可見分光光度計.生物量采用脂磷法測定.
1.4.2 微生物多樣性的測定
DNA的提取與PCR的擴增:為了探究系統(tǒng)的特殊結(jié)構(gòu)：莢膜、鞭毛、菌毛群落，在反應(yīng)的饑餓期和恢復(fù)期進行取樣.采用E. Z. N. A. Soil DNA試劑盒，按照試劑盒說明書提供的操作控制步驟提取.提取的DNA用1%瓊脂凝膠電泳進行檢測. PCR的擴增區(qū)域為16S rRNA的V3-V4區(qū)，細菌16S rRNA擴增引物采用通用引物.引物名稱和引物序列分別是338F 和806R . PCR反應(yīng)體系: Forward primer ，2 μL;Reverse primer ，2 μL;dNTPs ，4 μL;10×PCR buffer，5 μL;Pyrobest DNA Polymerase ，0.3 μL;補充ddH2O至50 μL.反應(yīng)程序:先95℃預(yù)熱5 min;然后進行25個循環(huán)，最后72℃延伸10 min.用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒 回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)Tris-HCl洗脫后，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測.根據(jù)電泳結(jié)果.將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM -ST 進行定量，按照每個樣品的測序量要求，進行相應(yīng)比例的混合.
MiSeq文庫構(gòu)建與測序:用高通量測序平臺Illumina MiSeq對擴增產(chǎn)物進行MiSeq高通量測序.測序得到的PE reads根據(jù)overlap關(guān)系進行拼接，同時過濾掉低質(zhì)量的reads，區(qū)別樣品后進行OUT聚類分析和物種分類學分析.
生物多樣性和分類學分析(Analyse):首先將序列按照彼此的相似性歸為操作分類單元.按照97%相似性進行OUT聚類，采用RDP classifier對97%相似水平的OUT代表序列進行分類學分析.利用MOTHUR軟件對樣品覆蓋率，ACE，Chao豐富指數(shù)以及Shannon多樣性指數(shù)進行計算.同時為了保證分析的高可信度，根據(jù)SILVA106庫中的參考序列對OUT進行種屬鑒定，種屬比對的可信度閾值設(shè)定為80%.
2 結(jié)果與討論2.1 反應(yīng)器運行情況
穩(wěn)定期、饑餓期和恢復(fù)期的硫自養(yǎng)1號和2號反應(yīng)器進出水水質(zhì)的變化情況如圖 2所示.進水NO3--
N、NO2--
N、TN和TP平均濃度分別為30.00、0.01、35.88和1.00 mg?L-1.穩(wěn)定期，反應(yīng)器在低溫下 運行30 d后，1號反應(yīng)器出水NO3--
N、NO2--
N、TN和TP濃度分別為1.78、0.03、2.87和0.91 mg?L-1，TN去除率為91.9%，1號反應(yīng)器具有較高的脫氮效果. 2號反應(yīng)器出水NO3--
N、NO2--
N、TN和TP濃度分別為11.32、0.11、13.10和0.14 mg?L-1，TN和TP去除率分別為63.49%和86.41%. 2號反應(yīng)器具有同步脫氮除磷(P)的效果.
圖 2 饑餓前后反應(yīng)器NO3--
N、NO2--
N、T
N、TP的變化
反應(yīng)器穩(wěn)定運行后，停止進水，進入饑餓期.經(jīng)過30 d的饑餓忍耐后，反應(yīng)器在低溫下 恢復(fù)進水，進入恢復(fù)期.由圖 2可以看出，饑餓忍耐后，1號反應(yīng)器出水NO3--N增加到27.87 mg?L-1，2號反應(yīng)器出水NO3--N增加到26.56 mg?L-1.但隨著反應(yīng)器的恢復(fù)，出水NO3--N濃度逐漸降低，1號反應(yīng)器經(jīng)5 d的恢復(fù)，出水NO3--N和TN濃度分別為0.38 mg?L-1和2.37 mg?L-1，去除率分別為98.8%和93.6%;2號反應(yīng)器經(jīng)11 d的恢復(fù)，出水NO3--N和TN濃度分別為10.51 mg?L-1和12.91 mg?L-1，去除率為66.40%和65.57%.其次，在恢復(fù)期2個反應(yīng)器的出水NO2--N濃度均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，恢復(fù)初期均出現(xiàn)NO2--N的積累.由圖 2可知，1號反應(yīng)器恢復(fù)期第3 d 出水NO2--N濃度為2.17 mg?L-1;2號反應(yīng)器恢復(fù)期第5 d ，出水NO2--N濃度為0.37 mg?L-1.隨著反應(yīng)器穩(wěn)定運行，最終1號反應(yīng)器NO2--N濃度下降(descend)到0.1 mg?L-1以下，2號反應(yīng)器有0.1 mg?L-1 NO2--N的積累量.此外，饑餓忍耐未對2號反應(yīng)器TP的去除效果產(chǎn)生明顯的影響.原因如下，2號反應(yīng)器對磷(P)的去除主要是通過黃鐵礦中的鐵與磷結(jié)合形成鐵磷沉淀物及鐵的氧化（oxidation)物和氫氧化物對磷有吸附作用，饑餓條件下并未明顯影響這一物理化學過程.結(jié)果表明，與1號反應(yīng)器相比，2號反應(yīng)器的恢復(fù)時間略長，但2個反應(yīng)器都能在低溫、短期內(nèi)恢復(fù)到正常處理(chǔ lǐ)效果.
饑餓期 及恢復(fù)期 反應(yīng)器不同高度處微生物量的變化如表 1所示.從中可知，1號和2號反應(yīng)器饑餓忍耐后不同高度處微生物量均低于恢復(fù)期.分析原因，主要是饑餓期間反應(yīng)器中部分微生物對饑餓環(huán)境的忍耐能力差，裂解死亡;部分細菌因營養(yǎng)物質(zhì)缺乏而進入休眠狀態(tài)，不能進行生長繁殖.反應(yīng)器恢復(fù)進水后，生物膜的活性和生長可得到不同程度的恢復(fù)，使得微生物量有所增加，同時反硝化性能得以恢復(fù).
表 1 饑餓忍耐前后反應(yīng)器不同高度處生物量的變化/nmol?g
2.2 微生物多樣性的分析
利用MiSeq平臺對A1、A2、B1、B2這4個污泥樣品進行高通量測序，分別獲得39 989、39 302、45 227、61 572條優(yōu)化序列.將優(yōu)化序列截齊后與SILVA106庫比對后進行聚類，在97%的相似性下分別獲得3 188、3 412、1 734、1 976個OUTs.并且4個污泥樣品的覆蓋率 均在95%以上，表明本研究中構(gòu)建的序列庫可以覆蓋細菌群落的多樣性.
表 2 樣品的物種豐富度和多樣性分析
Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)表示微生物群落結(jié)構(gòu)的變化.群落豐富度用Chao指數(shù)描述，其值越高表明群落物種的豐富度越高;Shannon指數(shù)可以反映樣品的多樣性程度，其值越高表明群落物種的多樣性越高. 表 2顯示，4個污泥樣品的Chao和Shannon指數(shù)均為A2>A1>B2>B1.結(jié)果表明，1號反應(yīng)器中的物種豐度和多樣性均高于2號反應(yīng)器.分析原因，主要是黃鐵礦/白云石反應(yīng)器 中所用硫源為黃鐵礦，其硫含量低于硫磺.這使得硫磺/白云石反應(yīng)器 中的硫自養(yǎng)反硝化菌群因得到充足基質(zhì)而更好的生長.即由于基質(zhì)含量的不同，黃鐵礦/白云石反應(yīng)器中的自養(yǎng)反硝化菌種的生長受到一定的限制.另一方面，經(jīng)過30 d的饑餓忍耐后，硫磺/白云石和黃鐵礦白云石2個反應(yīng)器中微生物豐富度和多樣性明顯低于恢復(fù)期.分析原因，主要是饑餓期部分微生物對饑餓環(huán)境的忍耐能力差，裂解死亡，部分細菌因營養(yǎng)物質(zhì)缺乏而進入休眠狀態(tài);恢復(fù)期生物膜的活性和生長可得到不同程度的恢復(fù).這與上述反應(yīng)器中微生物量饑餓期低于恢復(fù)期的變化是一致的.
2.3 群落結(jié)構(gòu)分析
基于SILVA數(shù)據(jù)庫的分類信息，對饑餓期及恢復(fù)期污泥樣品的高通量測序數(shù)據(jù)進行了門、綱、屬水平上的分類分析.門分類水平上，4個污泥樣品共檢測出39個類群，門水平上的大量類群 如圖 3所示.從中可知，A1和A2樣品中Proteobacteria為優(yōu)勢（解釋:能壓倒對方的有利形勢)菌群，豐度分別為89.70%和89.77%，其次為Bacteroidetes 和Chlamydiae ，其他菌類比例相對較低. B1和B2樣品中Proteobacteria為優(yōu)勢菌群，比例分別為51.82%和55.42%.此外，Bacteroidete
S、Chlamydia
E、Chloroflex
I、Actinobacteri
A、Acidobacteri
A、Chlorob
I、Planctomycete
S、Verrucomicrobi
A、Gemmatimonadetes也是B1和B2樣品中主要的門類.結(jié)果表明，1號和2號反應(yīng)器在生物群落結(jié)構(gòu)和豐度上具有比較明顯的差異.兩組反應(yīng)器最主要的優(yōu)勢菌門雖均為Proteobacteria，但其相對豐度存在明顯的差異，且2號反應(yīng)器在門水平上的主要類群較為多樣.此外，每組反應(yīng)器饑餓期和穩(wěn)定期豐度變化不大.
圖 3 門水平上群落結(jié)構(gòu)
綱分類水平上，1號和2號反應(yīng)器中共檢測出68個類群，其中7個類群為主要的綱，如圖 4所示. A1和A2樣品中主要的綱類為β-GOOGLE PRoteobacteria，豐度為73.42%和69.15%，且β-Proteobacteria中的一些細菌是與污泥反硝化相關(guān)的[20~22];其次為α-Proteobacteri
A、γ-Proteobacteri
A、Sphinggobacteri
A、Chlamydiae . B1和B2樣品中主要的綱類為α-Proteobacteri
A、β-Proteobacteri
A、γ-Proteobacteria.此外B1和B2污泥樣品中還含有的δ-Proteobacteri
A、Ignavibacteri
A、Chlorobi
A、Actinobacteri
A、Anaerolinea
E、Acidobacteri
A、Gemmatimonadete
S、Phycisphaerae. 圖 4表明，不同樣品中類群結(jié)構(gòu)及豐度差異性較大，1號反應(yīng)器中β-Proteobacteria的相對豐度高于2號反應(yīng)器，2號反應(yīng)器中α-Proteobacteria和γ-Proteobacteria的相對豐度則高于1號反應(yīng)器.
圖 4 綱水平上群落結(jié)構(gòu)
屬分類水平上，1號和2號反應(yīng)器大量類群如圖 5所示.在屬水平上，2個反應(yīng)器中共檢測出296個細菌（fungus)類群.其中A1和A2樣品中主要屬類為Sulfobacillu
S、Variovorax以及Thiobacillus，其豐度分別35.67%、8.82%、19.54% 和31.98%、13.25%、11.86%.其中，Sulfobacillus是噬酸且耐熱的硫化物礦石氧化菌，也是亞鐵離子氧化菌. Thiobacillus為革蘭氏陰性細菌，是目前被報道最多的用于還原NO3--N的硫氧化細菌，可用于硫自養(yǎng)反硝化處理(chǔ lǐ)市政污水和地下水中的NO3--N.此外，A1和A2樣品中的主要類群 還包括Thermomona
S、Ferruginibacte
R、Denitratisom
A、Sulfurimona
S、Rhizobium.
圖 5 屬水平上群落結(jié)構(gòu)
與A1和A2樣品相比，B1和B2樣品中的主要類群包括Sulfobacillu
S、Variovora
X、Thiobacillu
S、Denitratisom
A、Ferruginibacte
R、Neochlamydi
A、Woodshole
A、Blastocatell
A、Bradyrhizobiu
M、Sulfuritalea等菌屬.并且不同時期反應(yīng)器中某些菌屬的相對豐度有一定的差別，如B1和B2樣品中Sulfobacillus和Thiobacillus在饑餓期和恢復(fù)期的相對豐度分別為0.06%、4.88% 和3.89%、0.70%。中空纖維膜紡絲機通過膜技術(shù)進行水處理，應(yīng)用于制藥、釀造、餐飲、化工、市政污水回傭、醫(yī)院、小區(qū)污水會用、造紙等生產(chǎn)生活污水處理。膜分離技術(shù)是一種廣泛應(yīng)用于溶液或氣體物質(zhì)分離、濃縮和提純的分離技術(shù)。膜壁微孔密布，原液在一定壓力下通過膜的一側(cè)，溶劑及小分子溶質(zhì)透過膜壁為濾出液，而大分子溶質(zhì)被膜截留，達到物質(zhì)分離及濃縮的目的。膜分離過程為動態(tài)過濾過程，大分子溶質(zhì)被膜壁阻隔，隨濃縮液流出，膜不易被堵塞，可連續(xù)長期使用。膜生物反應(yīng)器在污水處理，水資源再利用領(lǐng)域，MBR又稱膜生物反應(yīng)器（Membrane Bio-Reactor ）,是一種由膜分離單元與生物處理單元相結(jié)合的新型水處理技術(shù)。中空纖維膜紡絲機外形像纖維狀，具有自支撐作用的膜。它是非對稱膜的一種，其致密層可位于纖維的外表面／如反滲透膜，也可位于纖維的內(nèi)表面(如微濾膜和超濾膜)。對氣體分離膜來說，致密層位于內(nèi)表面或外表面均可。具體參見污水寶商城資料或
3 結(jié)論
顆粒硫磺/白云石和黃鐵礦/白云石反應(yīng)器經(jīng)過30 d的饑餓期后，分別需要5 d和11 d就可使NO3--N去除率恢復(fù)饑餓前的水平，且恢復(fù)期初期均出現(xiàn)NO2--N的積累現(xiàn)象.兩個反應(yīng)器在短時間內(nèi)均能恢復(fù)穩(wěn)定運行，在低溫條件仍能保持良好的脫氮效果.
高通量測序結(jié)果表明，黃鐵礦/白云石反應(yīng)器的細菌群落的豐度和多樣性低于硫磺/白云石反應(yīng)器.經(jīng)過30 d的饑餓忍耐后，兩個反應(yīng)器的細菌群落的豐度和多樣性均略低于恢復(fù)期.
微生物群落結(jié)構(gòu)的分析表明，顆粒硫磺/白云石和黃鐵礦/白云石硫自養(yǎng)反應(yīng)器的優(yōu)勢菌門均為GOOGLE PRoteobacteria，主要的綱類均為β-Proteobacteria.顆粒硫磺/白云石反應(yīng)器中存在起主要反硝化作用的Thiobacillus.
